Forscher wenden einen Long-Read-Ansatz an, um mehr über DNA-Mutationen und Krebs zu erfahren

So wie eine Taschenlampe einen breiteren Strahl wirft als die hellste Kerze, wenn man einen dunklen Pfad entlanggeht, so scheint auch die Long-Read-Genomsequenzierung ein breiteres genomisches Bild von DNA-Mutationen zu verdeutlichen als die Short-Read-Sequenzierung.

Neue EMBL-Forschung, kürzlich veröffentlicht in Zellgenomikweist darauf hin, dass die Long-Read-Genomsequenzierung wichtige Muster der chromosomalen Strukturumlagerung aufdecken kann, die zuvor der vorherrschenden Short-Read-Sequenzierung entgangen waren, die in der Krebsgenomik verwendet wird.

Eine vom EMBL Heidelberg, dem Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) und EMBL-EBI-Forschern gemeinsam geleitete Zusammenarbeit wendete neue Technologien an, um die Long-Read-Sequenzierung so zu nutzen, dass sie möglicherweise in klinischen Umgebungen angewendet werden könnte.

Short- vs. Long-Read-Sequenzierung

Wissenschaftler haben die Mutationslandschaften von Krebs seit langem erforscht, indem sie meist Short-Read-Genomsequenzierung verwenden. Die Short-Read-Genomsequenzierungstechnologie hat einen hohen Durchsatz, kann jedoch nur viele kurze DNA-Segmente erzeugen, die Forscher dann zusammensetzen, um Mutationen im Genom mithilfe von Computerwerkzeugen zu identifizieren.

Die Forscher vermuteten jedoch, dass dieser Ansatz einige Mutationsmuster unentdeckt ließ. Aus diesem Grund haben sie nach besseren Methoden gesucht, um die Auswirkungen somatischer Strukturvariationen (SSVs) auf die Zellfunktion zu analysieren. Diese SSVs sind Umlagerungen großer DNA-Abschnitte (z. B. Deletionen, Duplikationen usw.), von denen bekannt ist, dass sie mit den meisten krebsverursachenden Mutationen assoziiert sind.

Neuere Long-Read-Sequenzierungsmethoden (wie Oxford Nanopore, das in dieser EMBL-Forschung verwendet wird) bieten möglicherweise eine Möglichkeit, Mutationen in Krebsgenomen besser zu erkennen. Die Nanoporensequenzierung ermöglicht es Forschern, lange DNA- oder RNA-Fragmente in Echtzeit zu sequenzieren. Es funktioniert, indem es Änderungen eines elektrischen Stroms überwacht, wenn Nukleinsäuren – die Bausteine ​​von DNA und RNA – durch eine Protein-Nanopore geleitet werden. Das resultierende Signal wird rechnerisch dekodiert, um die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz zu ergeben.

Die Ausrüstung für die Long-Read-Sequenzierung ist kleiner, schneller und kann im Vergleich zur Short-Read-Sequenzierung längere DNA-Stränge lesen. Wie bei einem Puzzle mit weniger, größeren Teilen lassen sich die Sequenzen einfacher zusammensetzen. Darüber hinaus kann es Forschern ermöglichen, Veränderungen des Epigenoms bei Krebs zu verstehen.

„Wir wussten, dass wir mit der Short-Read-Sequenzierung kein vollständiges Bild bekommen“, sagte Tobias Rausch, leitender Bioinformatiker in der Korbel-Forschungsgruppe am EMBL Heidelberg und Hauptautor des Zellgenomik Papier. „Die Technologie ist jetzt an einem Punkt angelangt, an dem wir die Long-Read-Sequenzierung wirklich nutzen und aufdecken können, was gefehlt hat.“

Wie man ein bisher unentdecktes genomisches Muster identifiziert

Unter Verwendung von Zellen aus einem einzelnen Medulloblastom – einem primären Hirntumor im Kindesalter, die bei der Diagnose und nach der Behandlung gesammelt wurden, konnten die Forscher neue Methoden zur Analyse von Long-Read-Sequenzen verwenden, um ein neuartiges Mutationsmuster zu identifizieren, das zur Neuordnung längerer Abschnitte im Genom führt. die sie dann bei anderen Krebsarten bestätigen konnten.

„Wir haben von Anfang an verstanden, dass die Entwicklung von Methoden ein wesentlicher Bestandteil unserer Arbeit sein muss“, sagt Rausch. „Wie können wir die Long-Read-Sequenzierung am besten in einer Krebsgenom-Situation einsetzen? Die Bereitstellung von Methoden war ein wichtiger Teil dieses Projekts, und daraus sind eine Reihe von Werkzeugen hervorgegangen, die hoffentlich für die breitere Gemeinschaft nützlich sein werden.“

Über die bloße Methodik hinaus konnten die Wissenschaftler jedoch auch ein ziemlich komplexes Muster identifizieren und benennen, von dem sie glauben, dass es mit einer bestimmten Form der Mutation im Krebsgenom zusammenhängt, insbesondere beim Liposarkom, einem seltenen, aber manchmal tödlichen Krebs, der dafür bekannt ist, häufig a sehr instabiles Genom. Bisher blieb dieses Muster bei der Short-Read-Sequenzierung unentdeckt.

„Es ist nicht allzu überraschend, ein Mutationsmuster bei der Genomsequenzierung zu sehen, aber dies mit nur einer Probe zu tun und etwas zu haben, das die Menschen noch nie zuvor gesehen haben, war ziemlich auffällig“, sagte Jan Korbel, der das EMBL leitet Forschungsgruppe, der Rausch angehört. „Aber das liegt auch daran, dass die Short-Read-Sequenzierung es nicht zusammensetzen konnte. Jetzt sind wir in der Lage, solch komplexe Umlagerungen zu beobachten und tatsächlich ihre innere Struktur zu sehen.“

Wichtiges Know-how durch Zusammenarbeit

Ein wichtiger Teil des Forschungsprozesses hing von der Zusammenarbeit innerhalb des EMBL ab. Dazu gehörten Kollegen von GeneCore, das nach Rücksprache mit den Mitarbeitern zur Auswahl des richtigen Ansatzes einen Teil der eigentlichen Sequenzierung liefert, sowie vom European Bioinformatics Institute des EMBL in Hinxton, Vereinigtes Königreich, das Fachwissen in Bezug auf die Oxford Nanopore-Sequenzierung bereitstellte.

Für die Korbel-Gruppe begann vor fast fünf Jahren eine Diskussion mit Kollegen am EMBL-EBI, um an diesem Projekt zusammenzuarbeiten, aber es konnte nur realisiert werden, als die Technologie so weit ausgereift war, dass sie ihre wissenschaftliche Vision mit diesem langjährigen Ansatz und den folgenden umsetzen konnten Analyse-Tools.

„Die Long-Read-Sequenzierung bietet eine neue Möglichkeit, Genominformationen zu sehen – sowohl in Bezug auf strukturelle Variationen als auch auf DNA-Modifikationen wie Methylierung“, sagte Ewan Birney, stellvertretender Generaldirektor des EMBL, gemeinsamer Direktor des EMBL-EBI und einer der Forschungsgruppenleiter, die zusammenarbeiten an diesem Projekt. „Es ist wunderbar zu sehen, wie dieser neue Mutationsprozess durch diese neue Technologie beleuchtet wird.“

Ebenso half die Zusammenarbeit mit dem DKFZ nicht nur bei der Beschaffung von Gewebeproben, sondern brachte auch wichtige biologische Erkenntnisse in die Arbeit ein.

Am Horizont

Nachdem sie ein Mutationsmuster identifiziert haben, jedoch innerhalb nur einer einzigen Probe, erkennen die Forscher die Notwendigkeit von Folgestudien mit größeren Kohorten, um das Muster besser zu verstehen und festzustellen, ob es klinisch relevant ist. Derzeit werden nur sehr wenige Proben mit Long-Read-Genomsequenzierung untersucht.

„Es gibt jetzt wirklich viel Begeisterung für die Long-Read-Sequenzierung“, sagte Korbel. „Wir haben bereits Pläne, unsere Arbeit in größerem Umfang fortzusetzen, und mit dieser Arbeit werden wir uns wieder auf die Kooperationen verlassen, die wir begonnen haben – von denen einige jetzt Wege erproben, diese lang gelesene Sequenzierung im klinischen Umfeld anzuwenden, wobei Patienten im Allgemeinen tendenziell höhere Überlebensraten haben, wenn eine Sequenzierung durchgeführt wurde.“