Filmen von Proteinen in Bewegung, um ihre Funktionen zu verstehen

Proteine ​​sind die Schwergewichte der Biochemie. Diese kräftigen Moleküle fungieren als Bausteine, Rezeptoren, Prozessoren, Kuriere und Katalysatoren. „Proteine ​​sind die molekularen Maschinen, die alles Leben auf der Erde antreiben“, erklärte Mark Sherwin, Physikprofessor an der UC Santa Barbara. Natürlich haben Wissenschaftler viel Forschung darauf verwendet, Proteine ​​zu verstehen und zu manipulieren.

Ein Team unter der Leitung von Forschern der UC Santa Barbara, darunter Sherwin, hat Fortschritte bei der Bewältigung einer der großen Herausforderungen der modernen Wissenschaft gemacht: der Aufzeichnung von Proteinen in Bewegung in einer lebensechten Umgebung. Die Autoren diskutieren ihre Technik in Internationale Ausgabe der Angewandten Chemie. Der Ansatz könnte unser Verständnis davon, wie Proteine ​​ihre Arbeit erledigen, revolutionieren und das Design von Proteinen für bestimmte Zwecke leiten.

Eine gewaltige Herausforderung

Das Verständnis der Funktion eines Proteins erfordert mehr als nur eine Liste seiner Bestandteile. Für diese Moleküle erzeugt die Form die Funktion. Wissenschaftler haben in den letzten 20 Jahren enorme Fortschritte bei der Entschlüsselung der Form von Proteinen anhand der sie bildenden Aminosäurebausteine ​​gemacht.

Doch selbst die Form einer Maschine zu sehen, reicht oft nicht aus, um zu verstehen, wie sie funktioniert. „Stellen Sie sich vor, Sie sind ein Außerirdischer und sehen das Bild einer Nähmaschine“, sagte Sherwin. „Sie würden es schwer haben, herauszufinden, was es tut. Aber wenn Sie einen Film gesehen hätten, hätten Sie eine viel bessere Vorstellung.“

Leider ist dies eine große Herausforderung für Proteine. Obwohl es sich um relativ große Moleküle handelt, sind Proteine ​​immer noch nur wenige Nanometer groß, 100-mal kleiner, als wir selbst mit den leistungsstärksten Lichtmikroskopen auflösen können. Und sie existieren in nassen, matschigen Umgebungen, die der Kinematografie nicht förderlich sind.

„Eine der größten Herausforderungen in der Biologie im Allgemeinen ist es, Proteine ​​in Aktion zu sehen“, erklärt Co-Hauptautorin Shiny Maity, eine Doktorandin der Chemie. Für Wissenschaftler ist es viel einfacher, die Struktur von Proteinen zu untersuchen, wenn sie eingefroren sind. Um sie sich bewegen zu sehen, ist eine Technik wie Stop-Motion-Animation erforderlich: Starten Sie die Aktion, frieren Sie das Protein ein, nehmen Sie ein Bild auf, wiederholen Sie es. Dies ist oft sowohl für schnelle als auch für langsame Bewegungen unerschwinglich schwierig. Darüber hinaus kann das Schockgefrieren des Proteins seine Struktur beeinträchtigen.

„Unser Ziel ist es, den Gefrieraspekt vollständig herauszunehmen und die Bewegung des Proteins in einer so naturgetreuen Umgebung wie möglich zu betrachten“, sagte Co-Hauptautor Brad Price, ein Physik-Doktorand.

Eine komplizierte Technik

Dieses Papier demonstriert eine neue Methode, um die Bewegung von Proteinen in einer lebensechten Umgebung zu verfolgen, nachdem ihre Bewegung durch ein externes Ereignis (in diesem Fall einen sichtbaren Lichtimpuls) ausgelöst wurde. Die Autoren nennen die Technik TiGGER, für Time Resolved Gadolinium-Gadolinium Electron Paramagnetic Resonance. Es ist aufwändig und erfordert Quantenphänomene, qualifizierte Chemie, Spezialausrüstung und Biotechnik.

Bei TiGGER werden zwei Punkte auf dem Protein markiert und der Abstand zwischen diesen Markierungen verfolgt, während sich das Protein entfaltet und wieder faltet. Der Star der Show ist ein geladenes Gadoliniumatom oder -ion. Seine Elektronen ordnen sich so an, dass sich das Ion wie ein kleiner Magnet verhält. Wenn Sie es in ein starkes Magnetfeld legen, richtet es sich mit oder gegen das externe Feld aus und beginnt zu wackeln.

Wissenschaftler stecken das Gadolinium in einen molekularen Käfig, um es zu stabilisieren, und fügen ein chemisches Gerüst hinzu, um es mit dem Protein zu verbinden. Aber diese Bits sind nur mit einer Art von Aminosäure, Cystein, verbunden. Das Team musste also die Aminosäuren, die es markieren wollte, in Cysteine ​​umwandeln, ohne die Gesamtfunktion des Proteins zu beeinträchtigen. Diese Aufgabe wurde durch ein Cystein im Zentrum des Proteins, das für seine Funktion entscheidend ist, noch komplizierter.

„Das Spin-Label ist sehr strategisch gewählt“, sagte Maity. „Es ist groß genug, um nicht in den Kern des Proteins einzudringen, wo sich das funktionelle Cystein befindet. Aber es ist auch nicht zu groß, um die natürliche Form des Proteins zu stören.“

Das Wackeln oder „Präzessieren“ des Gadoliniumions wird durch die Nähe des anderen Tags beeinflusst, das sein eigenes wackelndes Gadoliniumion hat, das sein eigenes kleines Magnetfeld erzeugt. Diese Präzession ändert sich je nachdem, wie nahe die beiden Tags beieinander liegen. Messen Sie dieses Wackeln, und Sie können die Entfernung ableiten.

Genau das taten die Autoren mit einem Laser mit Lichtenergien, die etwas höher waren als die in einem Mikrowellenherd. Wenn die Frequenz dieser Sub-Terahertz-Wellen und die Präzession des Ions übereinstimmen, werden die Wellen absorbiert. Die Wissenschaftler maßen dann diese Absorption, um kleine Änderungen in der Präzession des Gadoliniums zu erkennen. Wenn sich die Absorptionsmenge mit der Zeit ändert, bedeutet dies, dass sich die Tags bewegen.

Fügen Sie etwas mehr Mathematik hinzu, und die Autoren könnten Ihnen sogar sagen, wie weit die Tags voneinander entfernt sind. „Wir wissen, dass wir die Entfernung als Funktion der Zeit erhalten können, aber es wird mehr Entwicklung brauchen“, sagte Price.

Ein leuchtendes Protein

Die Autoren wählten ein beliebtes und vielseitiges Protein aus, um TiGGER zu entwickeln. Ihr Modell gehört zur licht-, sauerstoff- oder spannungsempfindlichen (LOV) Proteinfamilie, insbesondere zu einem lichtaktivierten Protein namens AsLOV2. „LOV-Proteine ​​steuern Prozesse, die von zirkadianen Rhythmen in Bakterien, Pflanzen und Pilzen bis hin zum Phototropismus in Pflanzen und Mikroorganismen reichen“, sagte Co-Autor Max Wilson, Assistenzprofessor in der Abteilung für Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologie. „Zusammenfassend sind sie eng mit der Lichtsensorik verbunden.“

Diese Eigenschaft macht AsLOV2 bei Wissenschaftlern und Ingenieuren beliebt und einfach zu manipulieren. „Es ist interessant und ein perfekter Testfall“, sagte Price, „eine Situation, die das Beste aus beiden Welten bietet.“

LOV-Proteine ​​ermöglichen es Wissenschaftlern, Licht als „Fernsteuerung“ für eine ganze Reihe molekularer Prozesse in Zellen zu nutzen. „Wir verwenden es, um die Differenzierung von Stammzellen, die Bindung von Antikörpern, die Versteifung und Entspannung extrazellulärer Matrixproteine ​​​​und die Aktivierung zellulärer Signalwege zu kontrollieren“, sagte Wilson.

Assistenzprofessor Arnab Mukherjee von der Fakultät für Chemieingenieurwesen verwendet LOV-Proteine, um biochemische Prozesse in lebenden Zellen mithilfe von Fluoreszenz zu verfolgen, ähnlich wie ein Textmarker unter Schwarzlicht. „Im Gegensatz zu herkömmlichen fluoreszierenden Proteinen arbeiten LOV-Proteine ​​nach einem bestimmten Mechanismus, der ihr ‚Leuchten‘ auch unter sauerstofffreien Bedingungen sichtbar macht“, erklärte er. Dies bietet ein Werkzeug zur Untersuchung von Mikroben, die in anaeroben Umgebungen wie dem menschlichen Darm leben.

Aber es ist schwierig, diese Proteine ​​so zu konstruieren, dass sie das tun, was die Forscher wollen. Hier kommt TiGGER ins Spiel. Wenn Wissenschaftler wie Wilson und Mukherjee die Proteine ​​in Bewegung sehen können, könnten sie in ihren Designprozessen bewusster vorgehen.

Ein Blick in die Zukunft

Die leitenden Autoren Sherwin und Songi Han, ein Professor für Chemie, begannen 2006 mit ihrer Suche nach dem Filmen von Proteinen, aber TiGGER befindet sich noch in den Anfängen. Im Moment kann die Technik eine eindimensionale Trajektorie der Bewegung eines Proteins zwischen zwei Punkten erzeugen. Aber seine wahre Kraft kommt von der Wiederholung der Technik an mehreren verschiedenen Stellen. Dadurch können die Wissenschaftler die Bewegung des Proteins als Ganzes zusammensetzen. Sie können diese Bewegung dann auf ein Modell des Proteins abbilden, um einen Film ähnlich der CGI-Animation zu erstellen, der unsere Lieblingszeichentrickfiguren zum Leben erweckt.

Die Autoren konzentrieren sich darauf, die Technik zu optimieren, bevor sie die Zeit investieren, sie auf andere Seiten auf AsLOV2 anzuwenden. Sie arbeiten daran, das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen und die Abtastgeschwindigkeit ihrer Instrumente zu erhöhen. Das Team hofft auch, die zufällige Bewegung der Proteine ​​zu verlangsamen, wenn sie in Lösung suspendiert sind, was es ihnen ermöglichen sollte, schärfere Aufnahmen zu machen, als sie es jetzt können.

In der Zwischenzeit verwenden Price und Maity TiGGER, um einige grundlegende Fragen zu AsLOV2 zu beantworten. Warum zum Beispiel entfaltet sich das Protein über 1.000-mal schneller als es sich wieder faltet? Und wie beeinflussen Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie die Neufaltung beeinflussen, die Entfaltung? Sie untersuchen auch, wie heißere Bedingungen die Funktion des Proteins beeinflussen. Die Ergebnisse könnten Aufschluss darüber geben, wie Hafer – die Quelle von AsLOV2 – auf den Klimawandel reagieren wird.

Schließlich kann TiGGER in alle möglichen anderen Proteine ​​übersetzt werden, solange die Wissenschaftler die interessierenden Stellen in Cystein-Aminosäuren umwandeln können, ohne die Funktion des Proteins zu beeinträchtigen. „Biophysiker haben sich bemüht, Proteine ​​in Bewegung zu ‚filmen‘, um ein tiefes Verständnis ihrer biologischen Funktionen zu erlangen“, sagte Maity. „TiGGER hat das Potenzial, diesen Traum wahr werden zu lassen.“