Neues Verfahren zum Nachweis von RNA-Viren wie SARS-CoV-2

Experten der Universität Barcelona, ​​des Institute for Advanced Chemistry of Catalonia (IQAC-CSIC), des Institute of Microelectronics of Barcelona (IMB-CNM-CSIC) und des Aragon Nanoscience and Materials Institute of Aragon (INMA) – ein gemeinsames Institut von das CSIC und die Universität Zaragoza – haben ein neues Verfahren zum Nachweis von RNA-Viren entwickelt, das auf der Triplex-bildenden Sondentechnologie basiert.

Diese innovative Methodik eröffnet neue Möglichkeiten zum Nachweis von Viren wie SARS-CoV-2, dem Influenza-A-Virus (H1N1) oder dem Respiratory Syncytial Virus (RSV), einem Erreger, der Neugeborene befällt und eine sorgfältige Differenzialdiagnose erfordert.

Diese interdisziplinäre Studie ist im veröffentlicht Internationale Zeitschrift für Molekularwissenschaften.

Polypurin-Haarnadeln zum Einfangen viraler RNA

Die neue Methodik basiert auf der Fähigkeit von Polypurin-Haarnadeln (PPRHs), die von der Krebstherapiegruppe der UB entwickelt wurden, virale RNA einzufangen und einen hochaffinen Triplex zu bilden. Wenn diese Hybridstruktur mit einer molekularen Sonde verbunden und mit der Probe des betroffenen Patienten in Kontakt gebracht wird, wird ein Nachweissignal des viralen Agens erhalten. Die in der wissenschaftlichen Veröffentlichung vorgestellte Methode heißt Triplex Enhanced Nucleic Acid Detection Assay (TENADA).

„PPRHs sind unmodifizierte einzelsträngige DNA-Haarnadeln, die aus zwei spiegelnden Domänen antiparalleler Polypurine bestehen. Diese Domänen, die durch eine Thymidinschleife miteinander verbunden sind, sind durch intramolekulare Reverse-Hoogsteen-Bindungen verknüpft. Die molekularen Haarnadeln können einzeln spezifisch an Polypyrimidinsequenzen binden -strängige DNA (ssDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA) oder RNA-Viren über Watson-Crick-Bindungen und bilden so einen antiparallelen Triplex“, sagt Professor Carlos J. Ciudad vom Institut für Biochemie und Physiologie der UB.

Eine effektive und schnellere Methode als der PCR-Test

Ein Vorteil beim Nachweis viraler RNA besteht darin, dass die PPRH-Methodik ohne Intervention der reversen Transkriptase – des Enzyms, das RNA in DNA umwandelt – oder des Thermocyclers (des Geräts, das Proben genetischen Materials mit der Polymerase-Kettenreaktion oder PCR amplifiziert) angewendet werden kann ). Darüber hinaus hat er eine Sensitivität und Spezifität, die der des PCR-Tests entspricht, und kann Ergebnisse in weniger als einer Stunde liefern.

Als Teil der Studie verwendete das Team die Sandwich-Hybridisierungsstrategie in mehreren Biodetektionsgeräten. Diese Strategie verwendet zwei Oligonukleotide: eine Triplex-bildende PPRH-Haarnadel, die als Fangsonde fungiert, und ein markiertes, Duplex-bildendes DNA-Oligonukleotid, das als Nachweissonde fungiert.

„Die Triplex-bildenden PPRH-Haarnadeln wurden so konzipiert, dass sie an SARS-CoV-2-Polypyrimidinsequenzen binden, während die Nachweissonden als komplementär zu einer Region in der Nähe der Zielstelle der Polypyrimidine konzipiert wurden. Daher das Vorhandensein von SARS-CoV-2 RNA wird durch die Bildung des ternären Komplexes auf der Oberfläche des Biosensors nachgewiesen“, sagt Professorin Verónica Noé (UB-IN2UB).

Diese Methodik wurde in einem kompakten elektrochemischen Gerät implementiert, das eine elektrochemische Zwei-Elektroden-Zelle auf einem Chip – hergestellt im IMB-CNM-CSIC-Reinraum für Mikro- und Nanofabrikation – und eine Fluidkomponente auf Papier sowie in einem thermischen Lateral-Flow-System integriert implementiert in Nitrozellulose und unter Verwendung von plasmonischen Nanopartikeln und Thermopapier, das am INMA (CSIC-UNIZAR) entwickelt wurde.

TENADA: Anwendungen in der biomedizinischen Forschung

PPRHs werden in der wissenschaftlichen Literatur als Werkzeuge zum Gen-Silencing mehrerer Gene beschrieben, die hauptsächlich an Krebs beteiligt sind. Darüber hinaus wurden sie auch als Sonden in Biosensoren zum Nachweis kleiner RNA-Moleküle (miRNA) zur Bestimmung des DNA-Methylierungsstatus und zur Diagnose einer durch den Pilz Pneumocystis jirovecii verursachten Lungenentzündung eingebaut.

Nun erweist sich die neue TENADA-Methodik nicht nur beim Nachweis viraler Partikel als effektiv. Die hohe Affinität von PPRHs für virale RNA ist eine Eigenschaft, die angewendet werden kann, um den Virusreplikationsprozess zu hemmen. Aus diesem Grund werden nun auch die antiviralen Eigenschaften der Polypurin-Haarnadelclips CC1PPRH und CC2PPRH in mit SARS-CoV-2-Virionen infizierten Zellen der VeroE6-Linie untersucht.