Wissenschaftler bestimmen Struktur eines DNA-Schadens „Ersthelfer“

DNA wird oft mit einem Bauplan verglichen. Die bestimmte Sequenz von As, Cs, Gs und Ts in der DNA liefert Informationen zum Aufbau eines Organismus.

Was diese Analogie nicht erfasst, ist die Tatsache, dass unsere DNA ständig gewartet werden muss, um ihre Integrität zu bewahren. Ohne eine spezielle DNA-Reparaturmaschinerie, die routinemäßig Fehler behebt, würden die Informationen in der DNA schnell degradiert.

Diese Reparatur findet an Kontrollpunkten des Zellzyklus statt, die als Reaktion auf DNA-Schäden aktiviert werden. Wie ein Qualitätssicherungsagent am Fließband untersuchen Proteine, die am DNA-Schadens-Checkpoint beteiligt sind, die DNA der Zelle auf Fehler, unterbrechen gegebenenfalls die Zellteilung und führen Reparaturen durch. Wenn dieser Kontrollpunkt zusammenbricht – was als Folge von genetischen Mutationen geschehen kann – bauen sich DNA-Schäden auf, und das Ergebnis ist oft Krebs.

Obwohl Wissenschaftler in den letzten 50 Jahren viel über DNA-Schäden und -Reparatur gelernt haben, bleiben wichtige offene Fragen. Ein besonders verwirrendes Rätsel ist, wie ein Reparaturprotein namens 9-1-1-Klemme – ein „Ersthelfer“ für DNA-Schäden – sich an die Stelle eines gebrochenen DNA-Strangs heftet, um den Kontrollpunkt für DNA-Schäden zu aktivieren.

„Wir wissen, dass diese Bindung ein entscheidender Schritt ist, der notwendig ist, um ein effektives Reparaturprogramm zu initiieren“, sagt Dirk Remus, ein Molekularbiologe am Sloan Kettering Institute (SKI), der die Grundlagen der DNA-Replikation und -Reparatur untersucht. „Aber die beteiligten Mechanismen sind völlig unklar.“

Dank einer Zusammenarbeit zwischen dem Labor von Dr. Remus und dem des SKI-Strukturbiologen Richard Hite ist nun ein klares Bild davon entstanden, wie die 9-1-1-Klemme an Stellen mit DNA-Schäden rekrutiert wird. Die Ergebnisse, die die herkömmliche Meinung auf diesem Gebiet in Frage stellen, wurden am 21. März 2022 in der Zeitschrift veröffentlicht Natur Struktur- und Molekularbiologie.

Komplementäre Expertise führt zu überraschenden Ergebnissen

Die Entdeckungen sind aus einer Zusammenarbeit zwischen zwei Labors mit komplementärem Fachwissen hervorgegangen. Das Labor von Dr. Remus verwendet biochemische Methoden, um den Prozess der DNA-Replikation und -Reparatur zu untersuchen. Ein Hauptziel seiner Forschung in den letzten Jahren war die Rekonstruktion des gesamten DNA-Replikations- und -Reparaturprozesses in einem Reagenzglas, abgesehen von einer umgebenden Zelle.

Als Ergebnis dieser Bemühungen hat sein Labor mehrere Komponenten der Reparaturmaschinerie gereinigt, darunter 9-1-1-Proteine ​​und Proteine, die die Bindung von 9-1-1 an DNA erleichtern.

Dr. Remus erkannte, dass diese Komplexe, wenn sie mit atomarer Auflösung betrachtet werden könnten, eine Reihe von Standbildern der einzelnen Schritte des Reparaturprozesses liefern würden. Daraufhin wandte er sich hilfesuchend an Dr. Hites Labor.

„Ich sagte: ‚Wir haben diesen Komplex; können Sie uns helfen, seine molekulare Struktur zu bestimmen, um herauszufinden, wie er funktioniert?‘ Und das hat er getan.“

Dr. Hite ist Strukturbiologe mit Fachkenntnissen in der Anwendung einer Technik namens Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), die die Untersuchung von Proteinen und Proteinanordnungen ermöglicht, indem ihre feinkörnigen Bewegungen mit Auflösungen sichtbar gemacht werden, die die Positionen einzelner Aminosäuren aufzeigen können Säuren in den Proteinen. Ähnlich wie die Zahnräder und Hebel einer Maschine sind es diese Bewegungen von Aminosäuren, die es Proteinen ermöglichen, als Arbeitspferde der Zelle zu dienen, einschließlich derjenigen, die DNA reparieren.

„Als Dirk zu uns kam, stellten wir fest, dass viele der Tools, die unser Labor in den letzten Jahren entwickelt hat, perfekt geeignet sind, diese Frage zu beantworten“, sagt Dr. Hite. „Mit Kryo-EM sind wir in der Lage, nicht nur eine Struktur zu bestimmen, sondern ein Ensemble von Strukturen. Indem wir diese Strukturen in einem logischen Muster zusammenfügen, basierend auf den neuen Daten und früheren biochemischen Daten, können wir einen Vorschlag für machen wie diese Klemme funktioniert.“

Sie taten es und die Ergebnisse waren überraschend.

„Das von uns entwickelte Modell hatte interessante Merkmale, die dem widersprachen, was zuvor angenommen wurde, wie diese Art von Klammern auf DNA geladen werden“, sagt Dr. Hite.

„Als Rich die Struktur zum ersten Mal produzierte, dachte ich, er hätte sich geirrt, weil es gegen alle Erwartungen verstieß“, fügt Dr. Remus hinzu. „Heute, im Nachhinein, ergibt alles vollkommen Sinn.“

Ein neues Modell zum Öffnen und Schließen einer DNA-Klemme um DNA herum

Die 9-1-1-Klemme ist wie ein Ring geformt. Um seine Funktion zu erfüllen, muss es die gebrochene DNA an der Verbindungsstelle zwischen einem freiliegenden Ende eines Strangs eines doppelsträngigen DNA-Stücks umgeben, das an ein einzelsträngiges angrenzt. Folglich muss sich die Ringstruktur der 9-1-1-Klemme öffnen, damit die einzelsträngige DNA in die Mitte der Klemme schwingen und sich dann wieder um sie herum schließen kann. Dies geschieht nicht spontan, sondern wird durch einen anderen Proteinkomplex, den sogenannten Clamp-Loader-Komplex, ermöglicht.

„Bei allen bisherigen Studien war angenommen worden, dass sich Klemmen wie eine Sicherungsscheibe öffnen würden, wobei sich im Grunde die beiden offenen Enden der Klemme aus der Ebene drehen würden, um einen schmalen Spalt zu schaffen“, sagt Dr. Remus. „Aber was Rich beobachtet hat, ist, dass sich die 9-1-1-Klemme viel weiter öffnet als erwartet, und sie öffnet sich vollständig in der Ebene – es gibt kein Verdrehen wie im Sicherungsscheiben-Szenario.“

Die Wissenschaftler weisen darauf hin, dass das Lock-Washer-Modell seit zwei Jahrzehnten existiert und das Leitparadigma auf dem Gebiet dafür war, wie eine Klemme um DNA herum geladen wird. Aber in diesem Fall ist es falsch.

Eine weitere Überraschung war, dass beobachtet wurde, dass der 9-1-1-Clamp-Loader-Komplex DNA in der entgegengesetzten Orientierung von anderen Clamp-Loader-Komplexen bindet, die während der normalen DNA-Replikation auf unbeschädigte DNA einwirken. Diese Beobachtung erklärt, wie 9-1-1 spezifisch an Stellen mit DNA-Schäden rekrutiert wird.

Von der Grundlagenforschung zur translationalen Forschung

Abgesehen davon, dass sie eine zufriedenstellende Antwort auf ein grundlegendes biologisches Rätsel liefert, glaubt Dr. Remus, dass die Forschung letztendlich zu besseren Krebsmedikamenten führen könnte.

Viele bestehende Chemotherapeutika wirken, indem sie die DNA-Replikation von Krebszellen stören und die Art von DNA-Schädigung erzeugen, die normalerweise durch Reparaturprozesse behoben wird, die durch die 9-1-1-Klammer ausgelöst werden. Da Krebszellen bereits eine reduzierte Fähigkeit haben, DNA-Schäden zu reparieren, kann die Zugabe von DNA-schädigenden Chemotherapeutika die Fähigkeit der Zellen, ihre DNA zu reparieren, überwältigen und sie sterben. (So ​​wirken zum Beispiel Medikamente, die als PARP-Hemmer bezeichnet werden.)

Mit diesem neuen Wissen darüber, wie 9-1-1 mit anderen Reparaturproteinen und mit DNA interagiert, könnten Wissenschaftler möglicherweise Medikamente entwickeln, die speziell in diesen Schritt des Reparaturprozesses eingreifen und Chemotherapeutika noch wirksamer machen.

„Eines der großartigen Dinge an der Arbeit hier bei SKI ist, dass die Forschung eines Grundlagenwissenschaftlers der Ausgangspunkt für translationale Studien sein kann, die letztendlich zu besseren Behandlungen führen“, sagt Dr. Hite.