RNA-Viren, wie das Coronavirus, das COVID-19 verursacht, befinden sich in dem Moment, in dem sie eine Zelle infizieren, in einem Wettlauf auf Leben und Tod.
Diese Viren haben nur wenige Minuten Zeit, um ihre Replikationsmaschinerie in der Wirtszelle einzurichten, bevor die genetischen Anweisungen, die in ihren anfälligen RNA-Genomen enthalten sind – die zerbrechlicher als DNA sind – andernfalls durch die zelluläre Haushaltsführung zerstört würden. Bei Erfolg kann das Virus in weniger als 12 Stunden von nur wenigen Kopien seines RNA-Genoms auf eine halbe Million Kopien anwachsen, die in neue infektiöse Partikel eingebaut werden. Wenn nicht, stirbt das Virus.
In einer online veröffentlichten Studie vom 24. Januar Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), werfen Wissenschaftler des Morgridge Institute for Research ein neues Licht auf diese entscheidenden frühen Stadien der Virusinfektion und ihre Kontrolle. Die Forscher entwickelten neue Wege, um virale RNA-Replikationskomplexe aus Zellen freizusetzen und sie auf raffinierte Weise durch Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) sichtbar zu machen.
Cryo-EM kombiniert hochentwickelte Bildgebung mit umfassender Computeranalyse, um es Wissenschaftlern zu ermöglichen, schockgefrorene Moleküle in ihrem ursprünglichen Zustand mit molekularer bis atomarer Auflösung zu visualisieren, was revolutionäre Einblicke in die biologische Struktur liefert, die eine starke Grundlage für die Entwicklung von Therapeutika zur Bekämpfung von Krankheiten darstellen können.
Das Forschungsteam wird von Paul Ahlquist, Direktor des John and Jeanne Rowe Center for Virology des Instituts und Professor für molekulare Virologie und Onkologie an der University of Wisconsin-Madison, geleitet. Das Team umfasst die Wissenschaftler Hong Zhan, Nuruddin Unchwaniwala und Johan den Boon, den Morgridge-Forscher und UW-Madison-Assistenzprofessor für Biochemie Tim Grant sowie die Co-Autoren Andrea Rebolledo-Viveros, Janice Pennington, Mark Horswill, Roma Broadberry und Jonathan Myers.
Dieses Video veranschaulicht den molekularen Aufbau des „Proto-Kronen“-Kerns des RNA-Virusgenom-Replikationskomplexes. Diese ringförmige Anordnung enthält 12 benachbarte Kopien eines einzigen großen viralen RNA-Replikationsproteins. Bildnachweis: Morgridge Institute for Research
Die meisten Mikroben- und Wirtsgene funktionieren in großen Proteinkomplexen, die als molekulare Maschinen funktionieren. Die Strukturen dieser kritischen Anordnungen waren jedoch weitgehend unbekannt, was das Verständnis und die Kontrolle der relevanten Prozesse stark einschränkte. In 2017 stellte das Ahlquist-Labor unter Verwendung eines fortschrittlichen Modellvirus die erste vollständige Bildgebung eines viralen RNA-Replikationskomplexes und seine auffällige Organisation.
Sie fanden das elterliche virale genomische RNA-„Chromosom“ fest zusammengerollt in einem schützenden Membranvesikel, dessen eingeschnürten Kanal zum Zytoplasma sie als Ort der eigentlichen viralen RNA-Replikationsmaschinerie entdeckten – der dynamischen, multifunktionalen Maschine des Genomkopierens – in einem früheren unbekannter, 12-fach symmetrischer Ringkomplex, den sie „Krone“ nannten.
Jetzt in seinem neuen Papier in PNASpräsentiert das Team einen weiteren Sprung, indem es die komplizierte Struktur dieser molekularen Krone und ihrer Enzymkomponentendomänen mit atomarer bis nahezu atomarer Auflösung aufdeckt. Diese Ergebnisse mit dramatisch höherer Auflösung zeigen, wie die vielen unterschiedlichen Funktionsmodule dieser replikativen Maschine angeordnet sind, und bieten eine wesentliche Grundlage für die Ausarbeitung ihrer Anordnung, ihres dynamischen Betriebs und Möglichkeiten, beides zu beeinflussen.
Zum Vergleich sagt Erstautor Hong Zhan: „Die ersten Visualisierungen der Kronenmaschinerie durch unser Labor im Jahr 2017 waren wie die Identifizierung der Existenz und der allgemeinen Umrisse eines Gebäudes. Die neue Auflösung von 2023 ist wie das Zeigen feiner Details wie der elektrischen Verkabelung und Türschlösser.“
„In der Virologie“, sagt Ahlquist, „waren die Komplexe, auf die sich die Menschen bisher hauptsächlich konzentriert haben, die infektiösen Partikel, die sich zwischen den Zellen bewegen, die relativ einfach zu reinigen und zu untersuchen sind, weil sie sich aus den Zellen lösen.“
„Die meisten viralen Replikationsprozesse finden jedoch in der komplexen Umgebung innerhalb von Zellen statt“, fügt er hinzu. „Dies ist ein neues Kapitel, in dem wir in der Lage waren, in das Innere von Zellen vorzudringen, um noch kompliziertere virale Maschinen zu erfassen und detailliert abzubilden, die die zentralen Ereignisse der viralen Replikation ausführen.“
Teammitglied Johan den Boon stellt fest, dass sie unter anderem herausfanden, dass „die Krone aus zwei gestapelten 12-mer-Ringen eines riesigen viralen RNA-Replikationsproteins besteht, dessen mehrere Domänen alle Funktionen bereitstellen, die erforderlich sind, um neue Kopien der viralen genomischen RNA zu synthetisieren . Die Proteine in den oberen und unteren Ringen haben jedoch dramatisch unterschiedliche Konformationen, wobei sich ihre konstituierenden Domänen in unterschiedlichen Positionen relativ zueinander befinden.“
Eine Implikation ist, dass die gleichen Proteindomänen in den oberen und unteren Ringen auf unterschiedliche Weise operieren. Mehrere andere Merkmale unterstreichen, dass die Krone keine statische Struktur ist, sondern eine ausgeklügelte, aktive Maschine, die fortschreitet und eine Reihe von Bewegungen durchläuft, um ihre aufeinanderfolgenden Aktivitäten auszuführen. Basierend auf dieser Struktur und weiteren gezielten Experimenten klärt das Morgridge-Team die Funktionen und Konformationsgymnastik der Krone auf.
Ein weiteres wertvolles Ergebnis dieser Studien ist, dass der untere 12-mer-Ring ein Aufbauvorläufer ist, der sich vor den eigentlichen Schritten der RNA-Replikation bildet. Dieser „Proto-Kronen“-Vorläufer rekrutiert dann die virale genomische RNA-Matrize und andere Komponenten, um die Synthese neuer RNAs zu initiieren, und dient als Basis zum Zusammenbau des reifen Doppelring-Replikationskomplexes.
Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die Krone nicht nur neue Kopien des viralen RNA-Genoms synthetisiert, sondern auch dazu beiträgt, diese neuen Genome in nachgelagerte Prozesse der Genexpression und des Zusammenbaus neuer infektiöser Viruspartikel zu bringen. Die Krone scheint somit wichtige Funktionen für die Organisation vieler kritischer Phasen während der Infektion zu erfüllen.
„Es reicht aus, den Aufbau und die Funktion von RNA-Replikationskomplexen zu verlangsamen, um diese Viren abzutöten“, sagt Ahlquist. „Diese neuen Ergebnisse bieten eine starke Grundlage dafür, neue Wege dafür zu finden.“
Ahlquist und andere Teammitglieder loben das UW-Madison Cryo-EM Research Center (CEMRC) und seine Führung als entscheidend für ihren Fortschritt. CEMRC macht diese wertvolle Technologie zahlreichen Wissenschaftlern auf dem Campus der UW-Madison und als nationales Zentrum weit darüber hinaus zugänglich. Unter der Leitung von Biochemie-Professorin Elizabeth Wright bietet CEMRC fortschrittliche Fähigkeiten in praktisch allen Formen der Kryo-EM-Bildgebung.
Neuere Ergebnisse der Morgridge-Gruppe und anderer Forscher weisen darauf hin, dass die durch diese Studien offenbarten Prinzipien evolutionär alt sind und dass ähnliche kronenartige Komplexe für die Replikation der meisten, wenn nicht aller RNA-Viren dieser großen Klasse von zentraler Bedeutung sind. Dazu gehören das Coronavirus COVID-19 SARS-CoV-2 und viele weitere Krankheitserreger.
Dementsprechend könnten die konservierten zugrunde liegenden Prinzipien als Grundlage für die Entwicklung leistungsfähigerer antiviraler Breitbandstrategien dienen, die die Infektion nicht nur durch eine, sondern ganze Gruppen von Viren hemmen könnten, sagt Ahlquist.
Mehr Informationen:
Hong Zhan et al., Kronenarchitektur der Nodavirus-RNA-Replikation enthüllt Konformationsumschaltung von Proto-Kronen-Vorläufern und viralem Protein A, Proceedings of the National Academy of Sciences (2023). DOI: 10.1073/pnas.2217412120