Ein Durchbruch beim Verständnis der Zuckerbiologie vielzelliger Organismen

In vielzelligen Organismen gibt es drei Arten von Proteinglykosylierung. N-Glycosylierung, O-Mannosylierung und C-Mannosylierung. All diese Prozesse finden im endoplasmatischen Retikulum statt, und in allen heften Enzyme Zuckerreste an bestimmte Stellen im neu gebildeten Protein.

Während die N- und O-Glykosylierung gut untersucht sind, war die dritte Form, die C-Mannosylierung von Tryptophan-Seitenketten, den Forschern lange Zeit ein Rätsel. Obwohl 20 Prozent aller sekretorischen Proteine ​​sowie Membranproteine ​​davon betroffen sind, war bis vor kurzem unklar, wozu die Veränderung dient, wie die spezifischen Proteinsequenzen erkannt werden und wie die damit verbundene Enzymreaktion chemisch überhaupt möglich ist.

In einer internationalen Zusammenarbeit haben Forschende der ETH Zürich, des Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research (WEHI) in Australien, der University of Chicago und der Universität Bern nun die Struktur und Funktion des verantwortlichen Enzyms „Tryptophan C- Mannosyltransferase“ (CMT). Die entsprechende Studie wurde in der neuesten Ausgabe des Journals veröffentlicht Naturchemische Biologie.

CMT ist ein Mitglied der Glykosyltransferase-Enzyme der Kategorie C (GT-C), einer der drei Glykosyltransferase-Superfamilien. Das prominenteste Mitglied ist die Oligosaccharyltransferase (OST), die für die N-Glykosylierung verantwortlich ist.

Ähnlich wie die OST erkennt auch die CMT hochspezifische Sequenzen in Proteinen, mit dem Unterschied jedoch, dass bei Säugetieren vier verschiedene CMTs gleichzeitig vorkommen, die ebenfalls unterschiedliche Proteinsequenzen erkennen.

Zucker helfen Immunrezeptoren an die Zelloberfläche

Erst in den letzten Jahren wurden die notwendigen Werkzeuge wie spezielle Antikörper und massenspektrometrische Testmethoden entwickelt, um das Ausmaß der C-Mannosylierung untersuchen zu können. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess fast ausschließlich dort abläuft, wo eine Zell-Zell-Kommunikation essentiell ist, insbesondere bei Zytokinrezeptoren des Immunsystems und Adhäsions-GPCRs. Letztere dienen als „sensorische Antennen“ für wachsende Neuronen, die sich ihren Weg durch das Gehirn bahnen.

„Das Thema ist brandaktuell, insbesondere für unser Verständnis der Zell-Zell-Kommunikation des Immunsystems“, erklärt Kaspar Locher, Professor für Strukturbiologie an der ETH Zürich: „Signalmoleküle wie Zytokine steuern die Immunantwort während einer Infektion. Während diese und die damit verbundenen Rezeptoren seit Jahrzehnten intensiv untersucht werden, wurde lange Zeit vernachlässigt, dass die C-Mannosylierung darüber entscheidet, ob ein Zytokinrezeptor die Zelloberfläche erreicht, um seine Funktion auszuüben.“

„Mit unseren Einblicken in die Struktur der beteiligten Enzyme haben wir nun ein nahezu vollständiges Verständnis dafür, wie die C-Mannosylierung zu diesen Rezeptoren gelangt“, fügt der Erstautor der Studie, Joël Bloch, ehemaliger leitender Wissenschaftler in Lochers Gruppe, hinzu.

Maßgeschneiderter molekularer Baukasten

Den ETH-Forschern gelang es, das CMT-Enzym in Reinform herzustellen. Mit Hilfe von Chemikern von WEHI (AUS) und der Universität Bern bauten sie maßgeschneiderte Moleküle, die CMT-spezifische Proteinsequenzen und Zuckersubstrate nachahmen. Damit konnten sie das Enzym erstmals im Reagenzglas auf seine spezifischen Eigenschaften testen.

Die Forscher erkannten schnell, dass die Enzymchemie von CMT neu und völlig anders als die von OST sein muss. „Den Mechanismus eines Enzyms können wir in so einem Fall nur durch hochauflösende Strukturaufklärung herausfinden. Das Problem war allerdings, dass CMT bisher nicht kristallisiert werden konnte und wegen dieser Technik zu wenig Masse für die Kryo-EM hatte ist bei Proteinen unter 100 kDa besonders schwierig anzuwenden“, erklärt Locher.

Antikörper ermöglicht hochauflösende Elektronenmikroskopie

Ein Trick brachte schliesslich den Durchbruch: In Zusammenarbeit mit Forschenden der University of Chicago stellten die ETH-Wissenschaftler einen synthetischen Antikörper her, der spezifisch an das CMT bindet. Dieser Antikörper erhöhte die Masse des Enzyms so sehr, dass seine Struktur mit Hilfe von Kryo-EM aufgeklärt werden konnte. Mithilfe der Kryo-EM-Strukturen konnte die Gruppe um Kaspar Locher schließlich entschlüsseln, wie die verschiedenen CMT-Varianten unterschiedliche Proteinsequenzen erkennen.

Basierend auf diesen Erkenntnissen konnten die Forscher nun genauer vorhersagen, welche Proteine ​​im Menschen die Modifikation tragen. Daraus erhoffen sie sich, in naher Zukunft das „C-Mannosyl-Proteom“ erfassen zu können.

Durch die Entschlüsselung des Peptidbindungsmechanismus von CMT erhoffen sich die Forscher auch Fortschritte bei der Herstellung von CMT-spezifischen Inhibitoren. Solche Moleküle könnten zu Fortschritten in der Arzneimittelproduktion beitragen, beispielsweise zur Bekämpfung des Malaria-Erregers Plasmodium falciparum, der über ein eigenes CMT verfügt und dieses zur Anheftung an den Wirt benötigt.

Auch die Sequenz- und Organspezifität der humanen CMT-Variante CMT2 könnte genutzt werden, da sie eine Schlüsselrolle bei der Spermienentwicklung spielt. Die neuen Erkenntnisse könnten daher genutzt werden, um CMT2-Hemmer als Verhütungsmittel für Männer zu entwickeln.

Ein neuartiger Enzymmechanismus

Ein weiteres Rätsel für Wissenschaftler war der enzymatische Mechanismus von CMT. Dadurch entsteht eine einzigartige Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung zwischen Protein und Zucker. Mithilfe eines maßgeschneiderten CMT-Inhibitormoleküls konnten die Wissenschaftler CMT mitten in einer Glykosyltransferreaktion „einfangen“ und eine Kryo-EM-Struktur davon aufklären.

Dadurch konnten sie den CMT-Reaktionsmechanismus visualisieren: eine bisher unbekannte Form der elektrophilen aromatischen Substitution, die durch präzise angeordnete Seitenketten ermöglicht wird. Solche Erkenntnisse könnten zur Entwicklung von Designerenzymen beitragen, die Bindungen zwischen Kohlenstoffatomen katalysieren.

Evolutionär konservierter Schutzmechanismus in Glykosyltransferasen

Mit insgesamt vier verschiedenen Strukturen der CMT ist es den Wissenschaftlern erstmals gelungen, einen praktisch vollständigen Katalysezyklus eines Enzyms der GT-C-Superfamilie sichtbar zu machen.

Dabei deckten sie einen erstaunlichen Mechanismus auf: Die Zuckersubstrate der CMT sind aufgrund ihrer Lipidbindung aufwändig herzustellen und daher besonders wertvoll. Wie sich herausstellte, bindet das CMT sie zunächst in einer nicht reaktiven geschützten Bindungstasche. Erst wenn das zu modifizierende Protein oder Peptid an die CMT andockt, wird das Zuckersubstrat durch einen Peptidsensor verschoben und in einen hochreaktiven Zustand gebracht.

Die Wissenschaftler gehen davon aus, dass dieser Mechanismus in GT-C-Enzymen evolutionär konserviert ist und verhindert, dass wertvolle Substratmoleküle vorzeitig verbraucht werden. „Nachdem wir vor drei Jahren die allgemeine Architektur von GT-C-Enzymen aufgedeckt haben, haben wir jetzt ein ganzheitliches Verständnis ihrer Enzymchemie. Dies ist ein weiterer Meilenstein in der Glykobiologie“, erklärt Locher.