Bei der biologischen Bildgebung zielen die Forscher darauf ab, 3D, hohe Geschwindigkeit und hohe Auflösung mit geringer Photobleichung und Phototoxizität zu erreichen. Das Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (LSFM) trägt dazu bei, dieses Ziel zu erreichen. Basierend auf einem einzigartigen Anregungs- und Detektionsschema kann das LSFM lebende Proben mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung und geringer Photobleichung abbilden. Es hat ein großes Potenzial für die 3D-Bildgebung biologischer Proben gezeigt.
Das Prinzip der LSFM-Technologie besteht darin, die Probe mit einem dünnen Lichtblatt zu beleuchten und dann die emittierte Fluoreszenz entlang der Achse senkrecht zur Transmission des Lichtblatts zu sammeln. Daher werden nur Fluorophore in der Nähe der Fokusebene angeregt und detektiert. Die Verwendung eines dünneren Lichtblatts verbessert die axiale Auflösung, während ein längeres Lichtblatt das Sichtfeld (FoV) und die Abbildungsgeschwindigkeit verbessert. Kompromisse sind erforderlich, da es schwierig ist, ein dünnes, gleichmäßiges Lichtblatt zu erzeugen.
Mehrere Lichtblätter können gekachelt werden, um ein virtuelles Lichtblatt mit einem höheren Seitenverhältnis zu erzeugen. Mehrere Strahlen führen jedoch auch Seitenkeulen ein, wodurch die axiale Auflösung und die optische Schnittbildung verringert werden. Die axial gewobbelte Lichtblattmikroskopie (ASLM) verwendet einen Schlitz, um die Seitenkeulen zurückzuweisen. Es nutzt den Rolling Shutter des sCMOS, der natürlich als Schlitz dient, um die Strahlabtastung zu synchronisieren. ASLM kann ein beliebig großes FoV mit optimaler axialer Auflösung abbilden. Das Fluoreszenzsignal außerhalb des Rolling Shutters wird jedoch zurückgewiesen, sodass ein größeres FoV mit einer geringeren Photoneneffizienz erkauft wird.
Ein Forschungsteam des UTS-SUSTech Joint Research Center for Biomedical Materials Devices hat kürzlich eine photoneneffiziente Methode zur Vergrößerung des FoV entwickelt. Wie in berichtet Advanced Photonics Nexusführte das Team eine Bildgebungstechnik mit Superauflösung, die Bildabtastmikroskopie (ISM), ein, um eine ISM-verstärkte lateral gewobbelte Lichtblattmikroskopie (iLSLM) zu entwickeln.
Beim iLSLM wird zunächst eine „Lichtnadel“ erzeugt, indem ein fokussierter Strahl axial abgetastet wird. Wenn das Bild der Lichtnadel erfasst wird, wird eine Pixelzuweisung angewendet, um ein virtuelles dünneres Lichtblatt zu erzeugen. Anschließend wird die „Lichtnadel“ seitlich abgetastet, um ein komplettes Lichtblatt zu bilden. Im Gegensatz zum Schlitz verbessert die Pixelzuordnung die optische Schnittführung und die axiale Auflösung, ohne die Photoneneffizienz zu beeinträchtigen.
Die Forscher fanden heraus, dass sowohl iLSLM als auch ASLM in axialer Auflösung und optischem Schnitt viel besser sind als das herkömmliche Swept Focus Light-Sheet (SFLM), und iLSLM übertrifft ASLM, wenn eine Photoneneffizienz von >55 % erforderlich ist. Die aktuelle Arbeit von iLSLM basiert jedoch auf einer digitalen Pixel-Neuzuordnung, die die Bildgebungsgeschwindigkeit erheblich reduziert. In Zukunft werden die Forscher die optische Pixel-Neuzuordnung untersuchen, um die gleiche Bildgebungsgeschwindigkeit wie ASLM zu erreichen. In der Zwischenzeit eignet sich iLSLM für Anwendungen, bei denen das Ausbleichen durch Licht ein schwerwiegendes Problem darstellt oder die Probe anfällig für Phototoxizität ist.
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Liang Qiao et al., Lateral geschwenkte Lichtblattmikroskopie, verbessert durch Pixelneuzuordnung für photoneneffiziente volumetrische Bildgebung, Advanced Photonics Nexus (2022). DOI: 10.1117/1.APN.2.1.016001