Das Schöne an Live-Imaging-Studien ist, dass die Probe lebt, sodass Dynamiken wie Zellteilung und Embryonalentwicklung im Laufe der Zeit aufgezeichnet werden können.
Das Frustrierende an Live-Imaging-Studien ist jedoch, dass die Probe lebt – sie windet sich, windet sich und entkommt dem Sichtfeld. Außerdem ist es empfindlich und anfällig für Hitzeschäden oder Tod durch die Bildgebungsausrüstung selbst.
Eine technische Lösung für dieses Dilemma ist kürzlich aus dem MBL-Embryology-Kurs hervorgegangen, „ein klassisches Beispiel für die Zusammenarbeit hier am MBL“, sagt Carsten Wolff, MBL-Imaging-Forschungsspezialist.
„Während des Embryologie-Kurses 2021 haben wir begonnen, eine Technik zu entwickeln, die es uns ermöglicht, erwachsene C. elegans-Würmer über längere Zeiträume und mit hoher Auflösung mittels Lichtblattmikroskopie abzubilden“, sagt Wolff. Eine Gruppe von Lehrkräften und Mitarbeitern des Kurses hat in Zusammenarbeit mit MBL-Imagern das Protokoll während des Kurses 2022 verfeinert und das Papier verfasst, das diesen Monat in veröffentlicht wird Grenzen in der Zell- und Entwicklungsbiologie.
Der Fadenwurm C. elegans ist ein beliebter Organismus in der biologischen und biomedizinischen Forschung. Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) war sehr erfolgreich bei der Erfassung embryonaler Prozesse in C. elegans sowie in Mäusen und Zebrafischen. Aber sobald die Organismen ausschlüpfen, weist LSFM Grenzen auf.
Ein fünfstündiger Zeitraffer der dendritischen Verzweigung in einem PVD-Neuron von C. elegans, aufgenommen mit einem diSPIM-Lichtblattmikroskop. Das Video zeigt dendritische Verzweigungen auf der dorsalen und ventralen Seite des Mittelkörperabschnitts. Bildnachweis: Jayson Smith et al., Grenzen in der Zell- und Entwicklungsbiologie2022.
Bei C. elegans lag die Schwierigkeit in der Probenmontage. Aufgrund seiner optischen Eigenschaften eignet sich Low-Melt-Agar gut als Probenmedium für größere Organismen, aber die kleinen Spulwürmer neigen dazu, sich in den weichen Agar einzugraben und zu verschwinden. Folglich betrug vor diesem Protokoll die längste LSFM-Bildgebungszeit für erwachsene C. elegans 20 Minuten. Das neue Protokoll verlängert diese Zeit auf mehr als zwei Stunden und vermeidet Hitzestress in der Probe.
„Die von uns beschriebene Innovation ist im Wesentlichen eine Kombination aus zwei bekannten Montageansätzen“, sagt Wolff.
„Eines ist ein Biopolymer, das während der Probenvorbereitung viskos ist, aber sobald man es UV-Licht aussetzt, härtet es aus und hält die Probe (in diesem Fall C. elegans) unbeweglich. Der zweite Teil ist eine Befestigungsmethode in Kunststoffröhrchen, die das ermöglicht Verwendung von Lichtblattmikroskopie. Die Kombination ermöglicht die Live-Bildgebung von adulten C. elegans über einen Zeitraum von mehr als 2 Stunden.“
„Es klingt nach einer kurzen Zeitspanne, aber aufgrund früherer Probleme mit der Immobilisierung der Probe war dies nicht möglich. Auch die Bildgebung aus verschiedenen Winkeln, die LSFM ermöglicht, war aufgrund der ständigen Körperbewegung der Probe zuvor nicht möglich.“
Das Team verwendete das Protokoll, um die Verzweigung und Beschneidung der Dendriten eines sensorischen Neurons im Zeitraffer darzustellen. Und sie erwarten, dass es bessere Live-Bildgebungsstudien anderer wichtiger Zell- und Entwicklungsprozesse ermöglichen wird, wie z. B. Keimstammzellbiologie, Zellmigration, Zellteilung und Zellinvasion. Das Protokoll ist verallgemeinerbar, um mit anderen Organismen mit geringen oder keinen Änderungen zu arbeiten.
Mehr Informationen:
Jayson J. Smith et al, Ein Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopieprotokoll für Caenorhabditis elegans-Larven und Erwachsene, Grenzen in der Zell- und Entwicklungsbiologie (2022). DOI: 10.3389/fcell.2022.1012820