Ein Blick auf die Coronavirus-Infektion im Nanomaßstab

Eine menschliche Zelle, die mit einem Coronavirus infiziert wird, ist ein überfüllter Ort, da das Virus seinen Wirt in eine Virusreplikationsmaschine verwandelt. Jetzt haben Stanford-Wissenschaftler zum ersten Mal superauflösende Lichtmikroskopie verwendet, um die Menge zu sichten und zu bestimmen, wo sich virale Moleküle in der Zelle befinden.

WE Moerner, Professor für Chemie, und Stanley Qi, Assistenzprofessor für Bioingenieurwesen und Institute Scholar am Stanford ChEM-H, haben die Methode, die Wissenschaftlern einen Einblick in die Zelle im Nanomaßstab ermöglicht, verwendet, um genau zu bestimmen, wo in der Zelle bestimmte Teile der Zelle sind Coronavirus – wie das Spike-Protein und das genetische Material – befinden sich an verschiedenen Stellen nach der Infektion. Sie fanden heraus, dass die virusreplizierende Maschinerie und das RNA-Produkt dieses Prozesses im Gegensatz zu dem, was die konfokale Mikroskopie mit niedrigerer Auflösung gezeigt hat, in der Zelle physisch getrennt sind, was auf neue Details über den viralen Lebenszyklus hinweisen könnte.

Moerner, der Harry-S.-Mosher-Professor an der School of Humanities and Sciences und mit freundlicher Genehmigung Professor für angewandte Physik, und Qi untersuchten ein Coronavirus namens HCoV-229E, das wie sein Cousin SARS-CoV-2 aus a mit Spike-Proteinen besetzte Hülle, die einen RNA-Strang umgibt, das genetische Material des Virus. Dieser einzelne Strang genomischer RNA oder gRNA enthält die Anweisungen zur Herstellung aller Proteine, die das Virus benötigt, einschließlich derjenigen, die Kopien der gRNA erstellen, und derjenigen, die sich in der Verpackung zusammensetzen, die sich um die RNA wickelt, um ein neues, intaktes Virus zu erzeugen .

„Wenn sie infiziert ist, verwandelt sich die Zelle in einen Zombie, der völlig gedankengesteuert ist, um mehr Viren zu produzieren“, sagte Qi, der auch Assistenzprofessor für Chemie- und Systembiologie ist.

Wissenschaftler wissen viel darüber, welche Moleküle an welchen Schritten des viralen Lebenszyklus beteiligt sind. Aber wo genau in der Zelle all die Virusmoleküle während dieser Schritte sind, blieb weitgehend unbeantwortet. Das Verständnis dieser subtilen Details könnte einen besseren Einblick in die genaue Infektion von Zellen durch das Virus geben und Forschern dabei helfen, Schwachstellen zu finden oder bessere Behandlungen für Infektionen zu entwickeln.

In der Studie, die in veröffentlicht wurde Zellberichte Methoden Am 28. Februar konzentrierte sich das Team auf zwei verschiedene Formen von RNA: doppelsträngige RNA oder dsRNA, die ein Zwischenprodukt auf dem Weg zur Herstellung neuer Kopien des Virus ist, und gRNA, von der ein Strang injiziert wird Zelle, repliziert und dann in neue Viren verpackt. Wenn man genau weiß, wo sich diese Teile in der Zelle befinden, könnte man Wissenschaftlern nicht nur sagen, wo die Virus-Replikationsschritte (dsRNA) und Virus-Assemblierungsschritte (gRNA) stattfinden, sondern auch, wie diese Schritte räumlich koordiniert werden.

Zelluläre Galaxie

Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie ist eine gängige Methode, um Objekte innerhalb einer Zelle zu sehen, indem sie das Licht aufzeichnet, das von fluoreszierenden Markierungen oder Markierungen emittiert wird, die sich nicht wesentlich von den Molekülen unterscheiden, aus denen „Tagesglo“-Socken entstehen. Konfokale Mikroskopie kann jedoch nur bei Strukturen mit einem Durchmesser von etwa 250 Nanometern (nm) oder mehr genau sein. Coronavirus-Partikel sind mit einem Durchmesser von etwa 120 nm viel kleiner, und die darin enthaltenen Proteine ​​​​und RNA sind noch kleiner. (Als Referenz: Eine Haarsträhne ist etwa 100.000 nm dick.)

„An der grundsätzlichen Unschärfe der konfokalen Mikroskopie führt kein Weg vorbei“, sagt Moerner. „Viele wichtige zelluläre Objekte sind sehr klein; einige 50 nm, einige 10 nm und einige sogar noch kleiner.“

Die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie verwendet eine sorgfältig kontrollierte Bildgebung einzelner Moleküle, um diese zellulären Objekte schärfer zu fokussieren, sodass Wissenschaftler Objekte mit einem Durchmesser von nur 10 nm sehen können. Wissenschaftler können mit diesen Techniken jeweils nur eine einzelne Zelle betrachten, und die Experimente erfordern viel Zeit und spezialisierte Ressourcen. Trotz der Herausforderungen machen die unvergleichlichen Details, mit denen Wissenschaftler die Zelle betrachten können, den Prozess von unschätzbarem Wert. Und dieser Sprung in der Klarheit offenbarte Moerner und Qi etwas Unerwartetes.

Das Forschungsteam verwendete zwei unterschiedlich farbige Tags, um ihre beiden Moleküle zu betrachten, Magenta für gRNA und Grün für dsRNA. Zusätzlich zu grünen und magentafarbenen Flecken zeigten konfokale Bilder verschwommene weiße Wolken, die darauf hindeuteten, dass sich dsRNA und gRNA in der gesamten Zelle an derselben Stelle befinden könnten, möglicherweise zusammen in einer Art Partikel eingeschlossen. Aber durch die Verwendung von Superauflösungstechniken sah das Team etwas ganz anderes.

„Als ich diese Bilder zum ersten Mal sah, war es, als würde ich eine erstaunliche Galaxie betrachten“, sagte Moerner, der 2014 den Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung der Mikroskopietechniken erhielt, die Wissenschaftlern diese detaillierten Einblicke in die Zelle ermöglichen. Die superauflösenden Bilder zeigten einen dunklen Himmel mit leuchtend magentafarbenen Haufen und grünen Sternen – und keiner von ihnen überlappte sich jemals. Anders als es Konfokalbilder vermuten ließen, befinden sich dsRNA und gRNA niemals zur gleichen Zeit am selben Ort.

Separate Experimente, in denen sie auch Proteine ​​aus dem Virus und der Wirtszelle untersuchten, bestätigten, dass die Virus-replizierende dsRNA und das RNA-Produkt dieser Replikation niemals zusammen durch die Zelle schweben. Ihre Ergebnisse bestätigten, dass die virale Replikation in einem Teil der Zelle stattfindet, der als endoplasmatisches Retikulum oder ER bekannt ist, wie bereits bekannt war. Die gebildete gRNA knospt dann in die Zelle, um in ein vollständig ausgebildetes Virus verpackt zu werden. Im Gegensatz zu früheren Studien sahen Moerner und Qi nun jedoch, dass die virusreplizierende dsRNA nicht nur innerhalb des ER gefunden wird, sondern auch in großen (bis zu 450 nm) Kugeln, die keine gRNA in der gesamten Zelle enthalten . Sie vermuten, dass diese dsRNA-Blasen, die sich nicht aktiv replizieren, eine Art temporärer dsRNA-Speicher sein könnten, während neue Viren verpackt und versendet werden.

Erforschung antiviraler Behandlungen

Eine Virusinfektion ist ein komplexer Prozess, und obwohl das Team nicht genau weiß, was das Virus dazu antreibt, diese temporären Speicher von dsRNA zu produzieren, hoffen sie, dass die Superauflösung auch diese und andere Fragen in der Zukunft beantworten kann. Indem sie mehr darüber erfahren, wann und wo bestimmte virale Infektionsschritte stattfinden, können Wissenschaftler möglicherweise auch Behandlungen entwickeln und bewerten.

In dieser Studie haben sich die Forscher der Labore Moerner und Qi auch zusammengeschlossen, um zu untersuchen, was nach der Behandlung mit dem antiviralen Remdesivir passiert. Sie sahen, dass die Größe der dsRNA-Bläschen gleich blieb, während die Konzentrationen von gRNA und dsRNA in der Zelle insgesamt abnahmen, was ihre Theorie der vorübergehenden Speicherung stützt. Das Team hofft, dass weitere Studien mit dem Super-Resolution-Toolkit dazu beitragen könnten, festzustellen, ob andere Virostatika auf diese Bereiche abzielen könnten. „Wenn Menschen keine Werkzeuge haben, haben sie keine Möglichkeit, neue Erkenntnisse zu gewinnen“, sagte Qi.

„Dies ist ein großartiges Beispiel dafür, dass man nicht vorhersagen kann, was man findet, bis man sucht“, sagte Moerner. „Mit modernen optischen Werkzeugen im Nanomaßstab kann viel über die Biologie dieser komplexen Systeme gelernt werden.“